ENGLISH
新闻动态
News
华东理工大学开发高效NADPH再生系统
发布时间：
2023-07-18
在当前的制药工业中，酶催化的氧化还原反应起着至关重要的作用。作为最常用的氢供体，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）几乎占据了生物催化氧化还原过程的90%。然而，野生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（FDH）大多数依赖于NAD，相较于其他酶类工具如葡萄糖脱氢酶，其催化活性表现较差。因此，为了实现可靠且稳健的NADPH再生系统，需要开发高效且能够利用NADP的FDH。
T4T7 解码合成生物 2023-07-18 18:45 发表于上海
在当前的制药工业中，酶催化的氧化还原反应起着至关重要的作用。作为最常用的氢供体，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）几乎占据了生物催化氧化还原过程的90%。然而，野生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（FDH）大多数依赖于NAD，相较于其他酶类工具如葡萄糖脱氢酶，其催化活性表现较差。因此，为了实现可靠且稳健的NADPH再生系统，需要开发高效且能够利用NADP的FDH。
近日，华东理工大学许建和团队在《ChemBioChem》杂志发表了题为“Engineering a Formate Dehydrogenase for NADPH Regeneration”的研究论文，报道了一个新的来自杜氏假丝酵母的甲酸脱氢酶（CdFDH），通过结构引导的理性设计使得CdFDH未展现出严格的NAD偏好性，并具有良好的NADP利用能力，能够支持不同NADPH依赖的生物催化反应。
图1. CdFDH的蛋白结构和突变进化路径
在之前的研究中，该团队通过理性设计，成功改造了一个来自伯克霍尔德菌（Burkholderia stabilis）的NADP依赖性突变体（BstFDH-G146M/A287G）。然而，进一步的随机突变未能获得更高催化活性的突变体。因此，研究人员转向了其他FDHs，寻找更好的蛋白质工程起点。而CdFDH作为NADP依赖性FDH的一个全新成员，成为了理想的研究对象。通过结构引导的理性/半理性设计，CdFDH没有表现出严格的NAD依赖性，并且在构建的组合突变体CdFDH-M4（D197Q/Y198R/Q199N/A372S/K371T/∆Q375/K167R/H16L/K159R）中，其对NADP的催化效率（kcat/Km）提高了75倍。CdFDH-M4在多种不对称氧化还原过程中表现出色，其辅酶总周转数（TTN）范围从135增至986，使其具备潜力能够用于需要NADPH的生物催化反应。
图2. 野生型和突变体M4辅因子结合环境比较
之后，该团队以2.3 Å的分辨率成功得到了最佳突变体CdFDH-M4与NADP的共结晶（PDB：8J3P）。研究发现，与野生型相比，烟酰胺辅酶的结合环境发生了巨大的变化，因此导致了更好的NADP适应性。突变位点D197Q、Y198R和Q199N，CdFDH-M4在NAD(H)核糖的羟基附近提供了更大的空间，以容纳的磷酸基团，突变位点Gln197、Arg198和Asn199残基与NAD(P)H的磷酸基团也形成了氢键网络。此外，突变位点A372S则引入了全新的氢键网络（图2），并且，来自另一个亚基的Lys3与NAD(P)H的磷酸基团支持了额外的极性接触，而在野生型酶中没有观察到这种情况。
总之，这项研究成功改造了一种高效的NADP依赖的FDH突变体（CdFDH-M4），为烟酰胺辅酶的再生提供了有力支持。CdFDH-M4具有良好的NADP利用能力，能够支持不同类型NADPH依赖的生物催化反应。结构分析和分子动力学研究揭示了突变位点在促进底物/辅酶结合以及FDH催化循环转化方面的关键作用。同时，研究也为扩展NADPH再生系统提供了有价值的示例，为改进该FDH超家族的辅因子偏好性提供了启发。
相关新闻
